价格表
miRNAssay® qPCR RT Master Mix
| Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书 |
|---|---|---|---|---|
| MIR-101 | 200次份 | RMB 2,000 | -20℃ |
|
| MIR-101T |
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SuperPrep® miRNAssay® Cell Lysis & RT Kit for qPCR
| Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书 |
|---|---|---|---|---|
| MIR-201 | 100次份 | RMB 8,000 | -20℃ |
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| MIR-201T |
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说明
用高效逆转录酶 ReverTra Ace® 研发而成。使用该产品，可从纯化的总 RNA 中特异、灵敏地将 miRNA 合成为特征
1. 预混型试剂
逆转录试剂（5 x RT Master Mix）是在-20℃条件下也不会冻结的预混型试剂。仅需加入模板RNA，miRNA 特异RT引物和水即可快速简便的合成cDNA。同时，由于还添附了预混型no-RT Control，可非常简便地配制逆转录反应的阴性对照反应液。
2. 高特异性
提高了逆转录反应的特异性，减少非特异性反应可提高低浓度目标基因逆转录的准确性。
3. 检测范围广
高效、特异，逆转录反应范围广。
4. 用时短・操作简便
逆转录反应试剂中的缓冲液经过优化，可用于Realtime PCR 的 cDNA 合成，只需 35 分钟即可完成高效的逆转录反应。并且无需额外添加 RNase H即可去除可能会抑制定量 PCR 反应的残余RNA。。
5. 可从培养细胞和细胞外囊泡中直接合成高质量的 cDNA
专用于 qPCR 的 SuperPrep® miRNAssayTM 细胞裂解和逆转录试剂盒（Code No. MIR-201）可轻松制备含有 miRNA 的裂解液。可从培养细胞或分离的细胞外囊泡中轻松制备RNA裂解液，裂解液处理过的反应液可作为模板，直接进行逆转录反应，从而大大缩短反应时间。
优化的缓冲液成分还能有效抑制细胞成分（如 RNase）对 miRNA 的降解。由于 cDNA 合成是在 gDNA 去除处理后进行的，因此合成的 cDNA 质量更高，基因组 DNA 污染更少。
原理
本kit是使用环状构造的RT Primer （茎环RT Primer）来进行逆转录miRNA的试剂。
通过使用茎环RT Primer可以更有效的逆转录miRNA，并且还可以在逆转录的同时延伸长度（应用到Realtime PCR ）。
实验例
1. 使用同源 miRNA 确认特异性
将100 ng酵母总RNA与105拷贝的let-7a、let-7g及miR-98合成RNA混合后，分别采用本试剂盒（miRNAssay® qPCR RT Master Mix）和其他公司逆转录试剂进行cDNA合成。以合成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，通过比较Ct值差异（假设目标miRNA检测效率为100%）评估检测特异性。结果表明，本试剂盒对高同源miRNA具有优异的分辨能力。
检测目标序列：
Let-7a ︓5ʻ-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3ʼ
Let-7g ︓5ʻ-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU-3ʼ
miR-98 ︓5ʻ-UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU-3
2.Total RNA十倍梯度稀释体系（1 pg-100 ng）的cDNA合成
采用miRNAssay® qPCR RT Master Mix和let-7a特异性茎环结构RT引物，对Hela细胞来源的十倍梯度稀释总RNA（1 pg-100 ng）进行逆转录反应。取1/10体积的逆转录产物进行实时荧光定量PCR分析，同时使用其他公司逆转录试剂进行平行实验。 结果显示：本试剂组no-RT对照组未检测到扩增，可在1 pg-100 ng范围内实现let-7a的准确定量检测
3.从培养细胞裂解液中检测miRNA
使用SuperPrep® miRNAssay® Cell Lysis & RT Kit for qPCR [Code No. MIR-201]检测了K562（人慢性骨髓疾病细胞系）、HepG2（人肝癌衍生细胞系）、A431（人上皮样细胞癌症衍生细胞系）、Jurkat（人肝癌衍生细胞系）、HeLa（人宫颈癌衍生细胞系）的 5×104细胞裂解液中的miRNA，并合成六种 miRNA（let-7a、d、e、f、g ，miR-98）的cDNA。
这些cDNA 也是用同样的方法从培养细胞中纯化的 RNA 合成的。以每个 cDNA 为模板，使用我们的THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mix [Code No. QPX-201]进行Realtime PCR检测。
结果显示，从裂解液中合成的cDNA与纯化的RNA之间存在高度相关性，可用于6个不同的靶标和 5 种不同的细胞类型。
使用该产品，无需进行复杂的RNA纯化，即可通过Realtime PCR进行miRNA表达分析。
4. 外泌体裂解物中miRNA的检测分析
采用SuperPrep® miRNAssay® Cell Lysis & RT Kit for qPCR，对Hela细胞培养上清中分离的外泌体（2 mL上清提取量）进行裂解处理，使用9种miRNA（let-7a,c,d,e,f,g,i,miR-21,103）特异性茎环结构RT引物分别合成cDNA。同时对外泌体纯化RNA进行平行实验。
实时荧光定量PCR结果显示，外泌体裂解物与纯化RNA样本检测结果呈现良好相关性。本试剂盒可有效规避RNA纯化过程中的样本损失，显著提升检测准确性。
MIR-101
MIR-101T
5×RT Master Mix
400μL×1支
80μL×1支
5×RT Master Mix
no-RT Control
40μL×1支
10μL×1支
Nuclease-free Water
1.1mL×2支
440μL×1支
MIR-201
MIR-201T
5×RT Master Mix
800μL×1支
160μL×1支
5×RT Master Mix
no-RT Control
80μL×1支
16μL×1支
Nuclease-free Water
1.7mL×2支
440μL×1支
Lysis Solution
6.5mL×1支
1.3mL×1支
gDNA Remover
33μL×1支
10μL×1支
RNase Inhibitor
110μL×1支
22μL×1支
【注意事项】
*本产品中不含茎环RT引物，以及Realtime PCR试剂。Realtime PCR试剂的选择，推荐我司的高效Realtime PCR试剂THUNDERBIRD® Next SYBR™ qPCR Mix [Code No. QPX-201]、あるいはTHUNDERBIRD® Next Probe qPCR Mix [Code No. QPX-101]。
【纯化RNA】
(cDNA合成)
现在低温或冰块上进行以下制备。
5×RT Master Mix 2 μL
RT引物 X μL
RNA template Y μL
Nuclease-free Water 8-X-Y μL
total 10 μL
将反应液轻轻搅拌后，按以下温度进行孵育。
16℃, 30min.
42℃, 5min.
95℃, 5min.
4℃, hold
【培养细胞以及纯化细胞外囊泡（外泌体）】
(细胞溶解)
Lysis Solution 58.7 μL
RNase Inhibitor 1 μL
gDNA Remover 0.3 μL
total(A) 60 μL
<<>培养细胞的情况下>
确认细胞数，通过离心去除培养基。
用PBS(-)进行清洗。
用PBS(-)混匀，将浓度制备成1×107 cells/mL，再按5 μL一管，分装至微管中。
将事先混合好的细胞溶解液 (A) 60μL加入至管中。
室温情况下，置于VORTEX上10秒，再温孵育5min（最长10min）。
再70℃温孵育2min。
将微管移至冰块上。
<对于纯化的细胞外囊泡>
在 5 µL 纯化的细胞外囊泡试管中加入 10 µL 细胞裂解液(A)。
室温下用移液器或涡旋搅拌，孵育5min（最长 10 min）。
再70℃温孵育2min。
将微管移至冰块上。
(cDNA合成)
5×RT Master Mix 8 μL
RT引物 X μL
溶解液 8 μL
Nuclease-free Water 24-X μL
total 40 μL
将反应液轻轻搅拌后，按以下温度进行孵育。
16℃, 30min.
42℃, 5min.
95℃, 5min.
4℃, hold
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