Realtime RT-PCR
THUNDERBIRD® Next Probe One-step qRT-PCR 4×Mix是一款采用高效逆转录酶ReverTra Ace®和高效PCR酶TTx DNA Polymerase的双酶系统的一步法Realtime RT-PCR试剂盒。本产品适配TaqMan®探针法等主流的Realtime PCR检测方案。
该试剂通过将逆转录酶、PCR 酶及反应缓冲液预混为一体,显著简化反应体系配制流程。此外,由于逆转录反应和PCR在同一反应体系中连续进行,试剂仅需分装一次,特别适合高通量检测场景,同时有效降低样本间交叉污染风险。
同时,该产品采用了高效的酶,能够实现快速且高灵敏度的反应。它可在存在抑制PCR的生物源性成分等杂质的情况下进行高效扩增,也可用于同时检测多个基因的多重反应。
特别设计的冻干赋形剂体系不含甘油成分,支持冻干工艺处理。经冻干后的试剂在室温下稳定保存,运输时无需使用制冷剂。使用时仅需加入模板与水,即可立即进行Realtime PCR。经验证,冻干处理后也不会对产品性能产生影响。
● 快速·高灵敏度
采用探针法1-step qRT-PCR技术,可实现微量RNA样本的快速高敏定量检测,适用于RNA病毒及低丰度mRNA的精准分析。实验数据显示,即使在"10秒延伸时间的快速扩增循环"条件下,其扩增效率仍与"45秒延伸标准循环"保持等效性。
● 简便操作
预混体系整合了逆转录酶、DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTP等核心组分,有效降低交叉污染风险与移液操作误差,显著提升实验重复性。
● 高抗干扰特性
采用高耐受性酶,可有效克服生物样本中常见抑制剂(如血红素、肝素等)对扩增反应的干扰,确保复杂样本检测的可靠性。
● dUTP防污染设计
体系内含dUTP成分,配合Uracil-N-Glycosylase(UNG)*使用,可有效预防Carryover污染导致的假阳性现象。
*注:本产品不含UNG组分,建议搭配Uracil-DNA Glycosylase (UNG), Heat-labile [Code No. UNG-101]使用。
● 多重靶标同步检测
支持多色TaqMan®探针同步检测系统,允许在同一反应体系内完成内参基因与目的基因的共检测,显著提升基因定量分析的效率与数据可比性。
● 冻干制剂兼容性
配方采用无甘油设计并添加专用冻干保护剂,验证实验表明冻干制剂复溶后各项性能指标稳定,适用于现场检测与长期储存需求。
● 高速热启动
采用抗DNA聚合酶抗体的热启动技术,通过温度依赖性抗体失活机制,在有效抑制非特异性扩增的同时,确保酶活性的快速释放与高温环境下的稳定性。
1.检测灵敏度对比
我们采用 TaqMan 探针,将本公司产品在检测腮腺炎病毒 RNA 时的灵敏度及定量性能,与其他公司产品进行了比较。检测仪器均为Applied Biosystems®StepOnePlus™。 结果显示,仅使用本产品时,能够检测出含量低至 10 拷贝以下的RNA,并且可在较宽的动态范围内完成定量分析。这表明,本试剂盒在检测 RNA 病毒,以及对表达量较低的mRNA进行检测和定量方面具有显著效果。
2. 延伸 10 秒高速循环条件下的 RNA 检测比较
针对流感病毒 RNA 检测体系,本研究对比了常规循环参数(延伸 45 秒)与高速循环参数(延伸 10 秒)的扩增效率。。检测仪器均为【Applied Biosystems®StepOnePlus™ 】。 实验结果表明,高速循环条件下的扩增效率与常规参数组无显著差异。即使在延伸时间仅为10秒的高速循环条件下,也能够实现高效的扩增反应。
THUNDERBIRD Next Probe One-step qRT-PCR 4×Mix
1.25mL×1支
50×ROX reference dye*100μL×1支
(50μL反应体系可用100次、20μL反应体系可用250次)
*ROX溶液是另外添加的,可以对应几乎所有的荧光定量PCR检测仪器。
RNase free water XμL
THUNDERBIRD Next Probe One-step qRT-PCR 4×Mix1.25μl
Forward Primer25pmol
Reverse Primer25pmol
TaqMan® probe10pmol
50×ROX Reference dye*1 1/0.1μL
(Uracil-N-Glycosylase 1unit*2)
RNA溶液 YμLL
*1 50×ROX reference dye,是对于使用 Passive Reference 的仪器(如Applied Biosystems 公司制造的仪器等),为校正各孔间的荧光强度及分注误差而使用。不用 Passive Reference 进行校正的仪器无需添加。
*2 使用Uracil-N-Glycosylase(UNG)处理时,请使用热敏性(heat-labile)UNG。可根据各公司推荐的条件,调整酶的用量。
时间 | ||||
Step | 温度 | 常规 | 高速 | |
逆转录反应 | 50℃ | 10分 | 10分 | |
初期变性 | 95℃ | 1分 | 30秒 | |
PCR | 变性 | 95℃ | 15秒 | 5秒 |
(40-45 | 延伸 | 60℃ | 45秒 | 10秒 |
cycles*3) | (退火) |
*3循环次数应为 40 个循环,如果扩增不充分,可增加到 45 个循环。
如果使用 UNG 处理,应在反转录反应之前设置 UNG 反应步骤。
上述一般温度条件和反应时间请根据各公司的建议进行调整。
本产品是得到Chakrabarti Advanced Technology NewCo LLC.公司US7772383专利的授权进行销售的。